risoluzione dei problemi con western blot

Risolvi i tuoi problemi di western blot con questi suggerimenti per la risoluzione dei problemi, coprendo le cause comuni di assenza di segnale, sfondo alto, più bande e altro ancora.

1. Nessun segnale
2. Sfondo alto.
3. Bande multiple.
4. "Macchie" bianche irregolari sulla macchia.
5. Punti neri sulla macchia.
6. Bande bianche su una macchia nera.
7. La corsia del marker del peso molecolare è nera.

1. Perché il mio Western blot non funziona?
2. Perché il mio Western blot è imbrattato?
3. Ti lavi dopo aver bloccato Western blot?
4. Quali sono le cause del legame aspecifico in Western blot?
5. Come posso migliorare i miei risultati western blot?
6. Perché usiamo il latte in Western blot?
7. Quali sono i passaggi del Western blotting?
8. Puoi trasferire un Western blot?
9. Come si conferma il trasferimento delle bande proteiche dal gel alla membrana nel protocollo Western Blot?
10. Per quanto tempo puoi bloccare un Western blot?
11. Puoi bloccare un Western blot durante il fine settimana?
12. Quante volte puoi rimuovere un Western blot?

Perché il mio Western blot non funziona?

Se hai una quantità insufficiente di proteine, se il tuo anticorpo primario non ha un'affinità elevata o se il tuo anticorpo primario ha una diluizione non ottimale, non vedrai la tua proteina. In alternativa, se carichi troppe proteine, il rapporto segnale / rumore potrebbe aumentare causando difficoltà di visualizzazione.

Perché il mio Western blot è imbrattato?

Qual è il motivo di una macchia in un western blot? Come puoi vedere dalla colorazione ponceau del trasferimento, c'è una macchia che attraversa tutte le prime 7 corsie. I campioni sono cellule staminali embrionali lisate con tampone campione 2xLSB, pipettando e bollendo. ... A quanto pare, lo striscio è dovuto a troppe cellule in un pozzo.

Ti lavi dopo aver bloccato Western blot?

Il blocco è un passaggio molto importante nella fase di immunorilevamento del Western blot perché impedisce il legame aspecifico dell'anticorpo alla membrana del blotting. Dopo il blocco, il blot viene risciacquato in tampone di lavaggio, solitamente TBST, con leggera agitazione e in un volume sufficiente per mantenere il blot sommerso. ...

Quali sono le cause del legame aspecifico in Western blot?

Una delle cause più comuni di bande non specifiche è il blocco incompleto. I tamponi bloccanti vengono utilizzati per impedire che gli anticorpi primari e secondari si leghino alla membrana o qualsiasi altra cosa diversa dalla proteina di interesse.

Come posso migliorare i miei risultati western blot?

Soluzione

1. Ridurre la concentrazione di anticorpi primari.
2. Diminuisci la quantità di proteine ​​totali caricate sul gel.
3. Regolare le condizioni di blocco della membrana.
4. Aumenta il numero di lavaggi.
5. Verifica la specificità dell'anticorpo.
6. Tamponare con l'anticorpo secondario da solo.
7. Se si sviluppano bande, scegli un anticorpo secondario alternativo.

Perché usiamo il latte in Western blot?

Il blocco è un passaggio molto importante del western blotting, poiché impedisce agli anticorpi di legarsi alla membrana in modo non specifico. Il blocco è spesso realizzato con il 5% di BSA o latte in polvere senza grassi diluito in TBST per ridurre lo sfondo. ... L'anticorpo può essere diluito in un tampone di lavaggio, come PBS o TBST.

Quali sono i passaggi del Western blotting?

Cinque passaggi sono coinvolti nella procedura di western blotting e nel test di rilevamento, ovvero trasferimento, blocco, incubazione di anticorpi primari, incubazione di anticorpi secondari e rilevamento di proteine ​​e analisi di western blotting.

Puoi trasferire un Western blot?

Con l'aumentare del tempo, tuttavia, esiste il rischio di trasferimento eccessivo (stripping, blow through) delle proteine ​​attraverso la membrana, soprattutto per un peso molecolare inferiore (<30 kDa) quando si utilizzano membrane con una dimensione dei pori maggiore (0,45 µm). Flusso di lavoro dell'elettrotrasferimento a umido / serbatoio di proteine ​​per western blotting.

Come si conferma il trasferimento delle bande proteiche dal gel alla membrana nel protocollo Western Blot?

Protocollo di trasferimento delle proteine

1. Preparare la membrana PVDF bagnandola in metanolo per 30 secondi e poi immergendola brevemente in acqua distillata seguita da tampone di trasferimento 1X. ...
2. Immergere le carte da filtro e le spugne nel tampone di trasferimento per 10 minuti prima dell'assemblaggio del sandwich di trasferimento.

Per quanto tempo puoi bloccare un Western blot?

In generale, il tempo massimo di blocco non dovrebbe superare le 2 ore a temperatura ambiente o le proteine ​​possono essere scambiate dalla membrana. Diluire l'anticorpo primario alla concentrazione / diluizione raccomandata in una soluzione bloccante fresca (TBS e / o PBS (PBS Tablets 524650-1EA) / 3% di latte in polvere senza grassi).

Puoi bloccare un Western blot durante il fine settimana?

Gli anticorpi a titolo forte funzionano meglio con un'incubazione breve e gli anticorpi per pneumatici deboli richiedono un'incubazione più lunga (a concentrazioni più elevate). Lasciare la macchia nel buffer di blocco durante la notte o durante il fine settimana a 4 ° C non fa male.

Quante volte puoi rimuovere un Western blot?

anche mentre stiamo cercando di rimuovere gli anticorpi primari è bene notare che c'è una probabilità che tu possa perdere parte della proteina che hai attaccato o trasferito sulla membrana quindi è consigliabile non spogliare la membrana più di una volta.